分析方法在藥學(xué)質(zhì)量研究中扮演重要的角色，普析手段目前還是在分析領(lǐng)域占據(jù)重要的位置，一般尤以RP-HPLC-UV占比最大，一個(gè)好的分析方法能有效檢出樣品中存在的所有雜質(zhì)，不遺漏某些雜質(zhì)的檢出，以免誤導(dǎo)工藝人員正確的開發(fā)。
分析方法的建立往往在原料藥的質(zhì)量研究中應(yīng)用頗多，選擇合適的分析方法建立思路，快速過渡，以QBD思想快速篩選，以獲得最優(yōu)的分析方法，對(duì)于質(zhì)量研究尤為重要。以下是我在實(shí)際工作應(yīng)用中對(duì)于方法建立等方面的一些心得。
分析方法建立的常規(guī)思路
仿制藥分析方法建立，一般有大量參考文獻(xiàn)，可以在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，事半功倍！
創(chuàng)新藥分析方法建立，一般參考文獻(xiàn)較少，在理論與經(jīng)驗(yàn)結(jié)合的基礎(chǔ)上快速建立方法！在RP-HPLC-UV建立之初，我們通常需要完成以下準(zhǔn)備：
原料藥與雜質(zhì)pKa判斷，以選取流動(dòng)相體系最佳pH值。
流動(dòng)相pH值一般選取pKa±2范圍之外，以保障化合物處于分子狀態(tài)，減少電離，此狀態(tài)下化合物疏水性較強(qiáng)，色譜柱保留時(shí)間較長(zhǎng)，能獲得良好的峰型。
- 酸性化合物，可以選擇非緩沖的流動(dòng)相進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，用單一的酸溶液（一般常用磷酸）進(jìn)行色譜分離，酸的濃度應(yīng)足以使pH值比需要值低的多。
- 堿性化合物，選擇是比較有限的，TEA/氨水可以用于調(diào)節(jié)到高的pH值，但是要求色譜柱能夠耐堿比較好。
2、流動(dòng)相緩沖鹽選取
緩沖體系選擇的要求：能適當(dāng)控制離子化、與檢測(cè)器兼容性、緩沖鹽溶液與有機(jī)相的互溶性、流動(dòng)相的pH是否在色譜柱的安全范圍內(nèi)。
常用的緩沖體系的鹽一般為磷酸鹽與醋酸鹽體系，其pKa見下表：
3、洗脫劑的選取
反相體系下，常用的洗脫劑為甲醇、乙腈與四氫呋喃。三種溶劑對(duì)比如下：
3、洗脫劑的選取
選擇性：α；柱效：N；保留因子：N
選擇性是影響分離度的最關(guān)鍵因素 ：
-
改變固定相
-
改變流動(dòng)相
柱效是最容易預(yù)測(cè)和改變的因素；
最理想的保留范圍：1＜K＜10
b. 影響分離度的色譜條件
a. API與雜質(zhì)溶解性
直接影響：雜質(zhì)提取不充分，檢測(cè)結(jié)果不平行，重現(xiàn)性結(jié)果差！
間接影響：回收率波動(dòng)較大，方法建立與方法驗(yàn)證結(jié)果不匹配。
主成分在稀釋劑中的飽和溶解度，最好滿足飽和溶解度大于3倍的供試品濃度。
b. 靈敏度
檢測(cè)靈敏度不滿足，高濃度溶解性會(huì)有問題，濃度太大，峰拖尾影響檢測(cè)，易損壞色譜柱，在遺傳毒性雜質(zhì)方法建立過程中尤為突出。
c. 酮式烯醇式互變
同一化合物有兩個(gè)響應(yīng)接近的峰，主峰伴隨著一個(gè)較大的未知峰，峰有臺(tái)階，互變影響峰型。
具體可參考占小兵老師的“HPLC方法開發(fā)需注意的典型特殊結(jié)構(gòu)化合物專題：酮式烯醇式互變”。
d. 溶劑效應(yīng)
優(yōu)先采用流動(dòng)相體系，降低溶劑強(qiáng)度（如增加水相比例，調(diào)整pH等）。
e. 極性化合物弱保留
強(qiáng)保留型色譜柱（AQ色譜柱…..），離子交換色譜柱，離子對(duì)試劑， HILIC模式。
離子對(duì)試劑
- 酸性化合物：四丁基氫氧化銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨等。
- 堿性化合物：烷基磺酸鹽類，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉等。三氟乙酸、五氟丙酸等全氟取代的直連有機(jī)酸等。
分析方法可靠性評(píng)估
防止漏檢雜質(zhì)，最重要的就是需要進(jìn)行分析方法可靠性評(píng)估，以判斷分析方法的適用性。
分析方法的建立，是一個(gè)系統(tǒng)的工程，在有參考文獻(xiàn)的條件下，需要評(píng)估方法的可靠性；線性洗脫程序的合理性，也是檢驗(yàn)方法適用性重要的一環(huán)。
常規(guī)做法：
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根據(jù)合成工藝路線及降解途徑分析可能產(chǎn)生雜質(zhì)的全面性。
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采用強(qiáng)制降解試驗(yàn)來判斷方法的適用性。
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延長(zhǎng)梯度洗脫高比例洗脫劑洗脫時(shí)間，防止小極性雜質(zhì)漏檢。
藥典方法不一定是最好的！
方法對(duì)比如下：
北京新領(lǐng)先雜質(zhì)研究事業(yè)部，致力于原料藥注冊(cè)申報(bào)及雜質(zhì)定向合成，通過雜質(zhì)定向合成及雜質(zhì)制備富集，獲取雜質(zhì)對(duì)照品，解決藥物研究中雜質(zhì)研究難點(diǎn)。通過制定有效的雜質(zhì)研究和控制策略，降低質(zhì)量研究工作量，縮短研發(fā)周期；創(chuàng)新分析方法，解決常規(guī)分析中分離與分析的難點(diǎn)，建立快速、穩(wěn)定的分析方法。
雜質(zhì)研究事業(yè)部由五個(gè)中心組成，分別為雜質(zhì)對(duì)照品中心、質(zhì)控中心、研發(fā)中心、工藝轉(zhuǎn)化中心和技術(shù)服務(wù)中心。分別對(duì)應(yīng)于雜質(zhì)定制、質(zhì)量研究、工藝開發(fā)、工藝轉(zhuǎn)化和技術(shù)服務(wù)。部門內(nèi)擁有Waters UPLC SQD2雜質(zhì)純化系統(tǒng)、GilsonGX-281型制備系統(tǒng)、Agela快速純化系統(tǒng)、創(chuàng)新通恒LC6000制備系統(tǒng)、WatersSFCⅡ型餾分收集系統(tǒng)等。能快速富集雜質(zhì)，根據(jù)MS信息，推測(cè)并獲得雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，解決未知雜質(zhì)來源、傳遞及控制策略。
雜質(zhì)研究事業(yè)部成員均具有多年原料藥開發(fā)和雜質(zhì)制備研究相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，尤其在抗生素領(lǐng)域獲得很多研究成果。目前可提供滿足申報(bào)要求的原料藥研發(fā)和全套雜質(zhì)定制服務(wù)，歡迎藥界朋友垂詢相關(guān)業(yè)務(wù)。
